1	Notions d’enzymologie
2	Un catalyseur Est un composé intervenant dans une réaction chimique sans être modifié, Accélère la réaction chimique sans modifier l ’équilibre de la réaction.
3	Une enzyme Puissant catalyseur, spécifique d ’une réaction chimique, est une protéine (sauf ribozymes), est régulée
4	Propriétés à connaître Site actif, substrat, coenzyme ou cofacteur, vitesse de la réaction, activateur, inhibiteur.
5	Phosphopyruvate dehydratase
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8	La classification des enzymes Oxydoréductases Catalysent les réactions d ’oxydo-réduction et utilisent des coenzymes (NADH, NADPH, FADH2). Transférases Catalysent les transferts de groupes chimiques (amino,carboxyl,carbonyl, methyl, acyl, glycosyl, phosphoryl …).
9	La classification des enzymes Hydrolases catalysent l ’hydrolyse de liaison C-R par addition d ’eau (peptidases, glycolases…) Lyases catalysent la coupure de liaison C-C, C-S ou C-N mais pas la liaison peptidique (decarboxylase,…) Isomérases catalysent l ’isomerisation d ’isoméres optiques.
10	La classification des enzymes Ligases catalysent la formation des liaisons C-O, C-S, C-N, … L ’énergie nécessaire provient en général de l ’ATP. Cette classification permet de donner un numéro à chaque enzyme.
11	La thermodynamique
12	Etat de transition et énergie d ’activation Nécessité de collision moléculaire, Les réactifs doivent avoir une énergie suffisante pour atteindre un état de transition, Les réactifs doivent être correctement orientés, Les liaisons et les angles de liaison vont être modifiés.
13	Mesure de l ’activité enzymatique
14	Historique de la définition d ’activité catalytique On a utilisé longtemps des unités totalement arbitraires, par exemple : les unités Bodansky ou les unités Bessey pour la détermination de l’activité de la phosphatase alcaline. En 1961, l’I.U.B. (International Union of Biochemistry) recommande l’emploi d’une “unité d’enzyme” : l’unité internationale (UI) qui est définie comme étant la quantité d’enzyme qui catalyse la transformation d’une micromole de substrat par minute dans des conditions définies (1 UI est équivalent à 1 mmol.min^-1).
15	La définition d ’activité catalytique Dès 1966 l’I.U.P.A.C.- I.F.C.C.1 I.F.C.C propose le catal (cat) qui en 72 devient le katal (kat) : quantité catalytique d’un système qui catalyse suivant un schéma réactionnel décrit, la transformation d’une mole par seconde (1 kat est équivalent à 1 mol.s^-1) En 1978 on adopte le terme d’activité catalytique (symbole z )
16	La mesure d ’une concentration de protéine Test de Bradford. C'est un test colorimétrique pour mettre en évidence et doser des protéines en solution. Il est basé sur l'utilisation du bleu de Coomassie G250 qui vire du rouge-brun au bleu en présence de protéine. La longueur d'onde maximale d'absorption du complexe bleu de Coomassie + protéine est de 595 nm. La méthode de Lowry Le Lowry est essentiellement un biuret dont la coloration est augmentée par le réactif de Folin-Ciocalteu, la sensibilité est ainsi augmentée d'un facteur 10. protéine + Cu++ --> complexe tetradentate-Cu+ --> + Folin phenol + complexe phosphomolybdique/phosphotungstique --> complexe bleu lu à 750 nm
17	La mesure d ’une concentration de protéine (suite) Le réactif est une solution verte constituée de CuSO4 et d'acide Bicinchoninique ou BCA. En milieu alcalin, les protéines réduisent les ions cuivriques Cu++ en ions cuivreux Cu+ qui forment avec le BCA un complexe coloré en pourpre. L'intensité de la coloration est directement proportionnelle à la concentration en protéine dans l'échantillon et peut être lue à 562 nm. Le dosage est compatible avec jusqu'à 1% de détergent ionique ou non-ionique.
18	Caractéristiques des dosages de protéines Gamme de Dosage et lecture Dosage BCA Micro BCA Lowry Pierce Coomassie Coomassie Plus
19	La définition de l ’activité spécifique
20	Michaelis-Mentens-Henry versus Briggs-Haldane Le deux grandes modélisation d ’une enzyme: État d ’équilibre versus État stationnaire
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23	"1)" 1) loi d ’action de masse 2) 3) loi de conservation de masse
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25	à l ’état stationnaire
26	Les représentations graphiques
27	Les représentations graphiques
28	Les représentations graphiques
29	Les représentations graphiques
30	Estimation statistique des paramètres de l’équation de Michaelis L’équation de Michaelis a été transformée pour pouvoir la présenter graphiquement sous forme de droite. Ce pendant cette transformation ne répond pas aux exigences statistiques, à savoir la variable y est mesurée et x est une variable fixée. Dans la transformation de Lineweaver-Burk, la transformation inverse modifie le poids des données et attribue un poids élévé aux données les moins précises (les concentrations faibles, par transformation inverse auront un pois élevé)
31	Estimation statistique (suite) Dans la transformation de Eadie-Hofstee, il y a mélange des variables indépendantes (concentration) et dépendantes (vitesse). La seule façon correcte d’estimer les paramètres Vm et Km est la régression non linéaire.
32	Utilisation de Genfit en XLSTAT Introduisez les données sur 2 colonnes Introduisez les estimations de départ pour Vm (la vitesse à forte concentration) et Km (la concentration approximative correspondant à Vm/2 Choisissez le menu XLSTAT-Modélisation des données - Genfit
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36	Le tableau des paramètres Celui-ci est complété (en rouge) par la valeur du t (paramètre/Ecart-type) et par la p-valeur (fonction loi Student en Excel)
37	Validation des paramètres Le paramètre est validé si la p-valeur < 0.05
38	Validation des données Cacul de la variance : SSR/(n-2) Calcul de l’écart-type : racine (variance) Calcul du résidu réduit : résidu/écart-type Validation de la donnée si le résidu réduit < Grubbs 0.01
39	Les inhibitions enzymatiques
40	Les différents types d ’inhibition
41	Les différents types d ’inhibition
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